بررسی ساختار و عملکرد فرم فعال فاکتور X انعقاد خون

Transcript

1 بررسی ساختار و عملکرد فرم فعال فاکتور X انعقاد خون 1 2 رقیه عباسعلی پورکیبره 1 رویا عوض پور ترکالکی گیتی کلانتریان* زهرا کریمی 1 نسرین شیخ 3 1. گروه بیوشیمی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی همدان همدان ایران 2. مرکز بهداشت غرب اهواز دانشگاه علوم پزشکی جندي شاپور اهواز ایران 3. گروه ژنتیک دانشگاه پیام نور تهران ایران چکیده فاکتور انعقادي X یک پروتي ین مهم در مسیر انعقاد خون است. این فاکتور داراي ویژگیهاي ساختاري مهمی است که عملکرد این پروتي ین را تحت کلسیم بود. تاثیر قرار می دهد. هدف از این مطالعه بررسی شاخصهاي ساختاري-عملکردي فاکتور X فعال در حضور یونهاي فاکتور X داراي 4 دومین است که دومین گاما کربوکسی گلوتامیک اسید ) GLA ( داراي آمینواسید هایی با بار منفی و همچنین آمینواسیدهاي آب گریز است. این دو گروه آمینواسید با ویژگی متضاد نقش اتصال به یونهاي کلسیم و غشا را به ترتیب برعهده دارند و پیچ خوردگی سه بعدي مناسبی را در حضور یونهاي کلسیم به فاکتور X میدهند. دومینهاي شبیه به فاکتور رشد اپیدرمی ( SP) و سرین پروتي از GLA میباشد نیز رابط بین دومین و 7EGF2 که شامل EGF1 ( Epidermal growth Factor ) میباشند و در اتصال به کلسیم نیز نقش دارند. روش کار : روش گردآوري و جمعبندي اطلاعات از پژوهش مولکولی انجام شده در این زمینه بوده است. که شامل توصیف ویژگیهاي ساختاري و سه بعدي فاکتور X بوده است. نتیجه گیري : نقش کاتالیتیکی فاکتور X برعهده دومین سرین پروتي از می باشد که این دومین زنجیره سنگین فاکتور X را تشکیل میدهد و آمینواسیدهاي این دومین در اتصال فاکتور X به مهار کننده و فعال کنندههاي مختلف نقش دارند. واژگان کلیدي : فاکتورX یون کلسیم دومین GLA دومین سرین پروتي از مقدمه فاکتور انعقادي X یک پروتي ین وابسته به ویتامین K می باشد که از خانواده سرین پروتي ازها میباشد و بدین ترتیب نقش اساسی را در مسیر انعقاد خون ایفا می کند. این فاکتور در کبد و به صورت تک زنجیره ایی ساخته میشود. در پلاسما فاکتور X به صورت گلیکوپروتي ین ) KDa59 ( دو فاکتور X زنجیرهایی است. زنجیره سبک از زنجیره سنگین طی یا بعد از ترشح در گردش خون جدا میشود. شامل 306 باقیمانده آمینواسیدي در زنجیره سنگین و 139 باقیمانده اسیدآمینهایی در زنجیره سبک است که توالی اولیه فاکتور X در شکل 1 نشان داده شده است. این دو زنجیره از طریق پیوند دي سولفیدي به هم متصل میشوند ) جدول 1). توالی فاکتور انسانی هومولوگ با دیگر فاکتورهاي انعقاد خون وابسته به ویتامین D از جمله فاکتور C پروتي ین VII, IX, XI پروتي ین S و پروتي ین Z است. از آنجایی که در پروتي ینهاي عملکردي به خصوص پروتي ینهاي درگیر در انعقاد خون ساختار سه بعدي پروتي ین ها بسیار مهم است و تغییر در آن یا در توالی این پروتي ینها سبب بروز بیماريهاي مختلف خونریزي مانند میشود ۱

2 بنابراین هدف از این مطالعه بررسی و شرح ویژگیهاي ساختاري و عملکردي فاکتور مهم انعقادي X بود.(1-3) شکل.1 توالی اولیە فاکتور X به صورت کد تک حرفی و تعداد آمینو اسیدهاي درگیر در هر دومین با درج نام هر دومین بر روي هر قسمت (2). و یونهاي کلسیم است. فعالسازي فاکتور X با این مجموعهها انتخابی است و شامل میانکنشهاي خاص بین سوبسترا ) فاکتورX ( و آنزیم ) فاکتور بافتی - فاکتور هفت یا فاکتور نه - فاکتور هشت فاکتور ( میباشد. جزي یات ساختاري میانکنش بین فاکتور X و کمپلکس آنزیمی در دست بررسی است ) 5 و ). 4 با فعال شدن کمپلکس ) TF-VII فاکتور بافتی یا ترومبوپلاستین ( (مسیر بیرونی) یا کمپلکس IXa- VIIIa (مسیر درونی) در حضور فسفولیپیدها و یون کلسیم فاکتور X فعال شده ) Xa ( و همراه با فاکتور V برروي سطح غشا کمپلکس پروترومبیناز را تشکیل میدهد. این کمپلکس پروترومبین را به ترومبین در حضور یونهاي کلسیم تبدیل میکند. موتاسیونهایی در فعالیت عملکردي فاکتور Xa همراه با فاکتور V بر روي سطح غشا کمپلکس پروترومبیناز را تشکیل میدهد. این کمپلکس در حضور یونهاي کلسیم پروترومبین را به ترومبین تبدیل میکند. موتاسیونهاي متعددي در ساختار فاکتور X شناخته شدهاند که منجر به اختلالاتی در فعالیت عملکردي فاکتور X و بروز خونریزي مغلوب اتوزومی نادر میشود (خونریزي میانه تا شدید) (6-8). مکانیسم فعال شدن فاکتورX فعال سازي فاکتور X با کمپلکس بیرونی X آز شامل فاکتور مجموعه TF-VIIa غشا فسفولیپیدي و یونهاي کلسیمی است. به طور مشابه کمپلکس درونی X آز شامل مجموعه FIXa/FVIIIa فسفولیپید میباشد ۲

3 جدول 1. پیوندهاي دي سولفیدي در دومینهاي مختلف فاکتور (3). X دومین GLA EGF1 EGF1 EGF1 EGF2 EGF2 EGF2 EGF2-SP SP SP SP SP موقعیت پیوند دي سولفید روش پژوهش: هدف از انجام پژوهش حاضر بررسی ویژگیهاي ساختاري و عملکردي فاکتور انعقادي X بوده که روش گردآوري و جمعبندي اطلاعات از پژوهش مولکولی انجام شده در این زمینه بوده است که شامل توصیف ویژگیهاي ساختاري سه بعدي فاکتور X بوده است و متعاقبا ویژگیهاي عملکردي آن مورد بحث قرار گرفت. بحث فاکتور X مانند دیگر فاکتورهاي انعقادي داراي دو زنجیره سبک و سنگین است. زنجیره سبک فاکتور X حاوي سه دومین ساختاري به نام دومین گاما کربوکسی گلوتامیک اسید (GLA) دو دومین مشابه فاکتور رشد اپیدرمی شامل EGF1 2 است که هر کدام ویژگی عملکردي مشخصی دارند. دومین GLA حاوي 11 باقیمانده اسیدآمینهایی- γ کربوکسی گلوتامیک اسید است که این دومین از Ala1 تا Gla39 قرار دارد ) جدول 2 ( 7) و.( 3 در ادامه دومین GLA یک بخش هیدروفوبیک کوتاه ) باقیمانده اسید آمینه ایی فنیل آلانین 40 تا لیزین 45 قرار دارد و بعد از آن EGF1 ) آسپارتات -46 فنیل آلانین 84 ( و EGF2 (تي ونین - 85 گلیسین ( 128 قرار دارد.(8) زنجیره سنگین فاکتور X شامل دومین سرین پروتي از است که این دومین عملکرد کاتالیتیکی فاکتور را برعهده دارد. فعالیت پروتي ولیتیکی فاکتور X با شکست پیوند پپتیدي بین آرژنین 194 و ایزولوسین 195 همراه است که پپتید فعال سازي را آزاد میکند. پپتید فعالسازي فاکتور X از طریق زنجیرههاي کربوهیدراتی با آسپاراژین 181 و 171 و احتمالا تري ونین 159 و 171 مرتبط میباشد. اتوپروتي ولیز اضافی فاکتور Xa در ناحیه پیوند پپتیدي بین آرژنین منجر به حذف پپتید کوچک از انتهاي کربوکسیل زنجیره سنگین میشود که فرم α فاکتور Xa را به فرمβ تبدیل میکند. با این حال تفاوتی در عملکرد این دو فرم هنوز مشخص نشده است (9 و ). 6 ۳

4 IX پروتي ین C S و Z وابسته به ویتامین K داراي 11 باقیمانده اسید دومین GLA فاکتور X مانند دیگر فاکتورهاي انعقادي VII II آمینه ایی Gla با سه جفت موقعیت یکساناند که این موقعیت ها عبارتند از 19:20 6:7 و 25:26 میباشد. برخلاف این ها فاکتور IXو X داراي اسید آمینە Gla دیگر در موقعیت 39 میباشند. Gla یکی از آمینواسیدهاي مهم در دومین GLA است که با تبدیل آن به لیزین از طریق موتاسوین به غشا فسفولیپیدي مشخص میگردد. ) شکل ( 2 ) 1-3). نقش مهم آن در اتصال به یون کلسیم و دخالت در فلدینگ پروتي ین و اتصال مناسب پروتي ین شکل 2. ساختار سه بعدي فاکتور X. نوار هاي زرد رنگ دومین سرین پروتي از را نشان می دهد نوار نارنجی رنگ و قرمز رنگ به ترتیب دومین EGF1 2 و بخش آبی رنگ دومین GLA را نشان میدهد. یونهاي کلسیم متصل به دومین GLA و EGF1 به صورت کرههاي سیاه رنگ توپر نشان داده شدهاند.( 13 ) لوپ فاکتورX Ω- همچنین Ω -لوپ متشکل از آمینواسیدهاي آلانین 1 تا گلیسین 11 میباشد و بر این اعتقادند که این لوپ براي اتصال دومین Gla به غشا نقش بسیار مهمی را ایفا میکند. گروه + NH3 از Ala1 از طریق ایجاد پیوند هیدروژنی با اتم اکسیژنGla16 اکسیژن Gla20 و اتم اکسیژن از تري ونین و پیوند یونی با Gla26 پایدار است. سه اسید آمینه هیدروفوبیک (فنیل آلانین 4 لوسین 5 و متیونین 8) به سمت بیرون از Ω -لوپ قرار میگیرند اتم سازنده ریشه اصلی این سه باقیماندة اسید آمینه ایی با همدیگر پیوندهاي ٤

5 و 3 هیدروژنی تشکیل داده و پایداري ایی را به Ω- لوپ 2 و.( 1 دادهاند. بنابراین این سه اسیدآمینه براي میانکنش با غشا دخالت دارند ) شکل بخش اصلی پایداري Ω- لوپ فاکتور X مربوط به شبکه Gla -کلسیم و شبکه پیوند هیدروژنی Ala1- Gla میباشد. شبکه پیوند هیدروژنی منحصر به فرد در Ala1 در جلوي دومین GLA با 4 آمینواسید γ- کربوکسی گلوتامیک اسید و 26 و تري ونین 21 تشکیل میگردد (3). فرم فاکتور X متصل به یون هاي کلسیم آمینواسیدهاي Gla در مرکز دومین Gla بوسیله یونهاي کلسیم احاطه میشوند و زنجیرههاي آمینواسیدهاي هیدروفوبیک فنیل آلانین 4 لوسین 5 و والین 8 را به سمت محلول قرار میدهند. در دومین Gla بدون کلسیم آمینواسیدهاي Gla به سمت محلول قرار گرفته و فنیل آلانین 4 5 و والین 8 یک خوشه هیدروفوبیک در بخش جلویی پروتي ین ایجاد میکنند (9). دومین, EGF1 2 در فاکتور X دومینهاي EGF به مقدار زیادي در پروتي ین موزاي یک خارج سلولی یافت میشوند و مشخصه آنها حضور سه باند دي سولفیدي در یک حالت ویژه است (جدول 2). دومین هاي EGF1 2 در فاکتور X و همچنین در دیگر پروتي ینهاي وابسته به ویتامین K به عنوان فضا پرکنهاي انعطافپذیر بین دومین GLA متصل به لیپید و دومین SP میباشند. این نقش عملکردي آنها در میانکنش پروتي ین-پروتي ین کاملا مشخص گردیده است. یونهاي کلسیم در اتصال دومین در جهتگیري آرایش دومینهاي GLA-EGF2 بسیار مو ثر است ) شکل 2) ).( 2 اتصال کلسیم به فاکتور Xa انسانی به ویژه قطعه GLA-EGF1 در مطالعات بسیاري بررسی شده است. مطالعات NMR برروي قطعە GLA-EGF1 در فاکتور Xa پذیر غشا است ) 6-8 ). پیشنهاد میکند که اتصال کلسیم به دومین GLA داراي نقش کلیدي در اتصال برگشت یونهاي کلسیم متصل به GLA-EGF1 در دیگر پروتي ینهاي وابسته به ویتامین K که حاوي دومین EGF میباشند نیز به همین صورت است. آرایش نسب دومینهاي GLA1 و EGF1 پیشنهاد میگردد که در حضور یونهاي کلسیم آرایش بهتري دارند. اتصال GLA-EGF1 از طریق یونهاي کلسیم است و تمایل این دو با هم 10 برابر بیش تر از حالت منفرد است. آمینواسیدهاي دخیل در میانکنش با کلسیم گلیسین و همچنین β- هیدروکسی آسپارتیک اسید 63 آسپارتات 64 و گلوتامین 49 میباشد ) شکل (2.(11) زیموژن فاکتور X داراي تعدادي پیوند هیدروژنی ) EGF2/AP ( activated peptide است که در فرم فعال تشکیل شده موجود نیستند زیرا در فرم فعال شده AP حذف میشود. آمینواسیدهاي تري ونین 136 لیزین 134 و آرژنین 139 همگی جفتهاي منظمی در فرم فعال شده دارند. آمینواسیدهاي دخیل در میانکنش بین دومینهاي EGF2 و SP آسپاراژین 93 تریپتوفان 308 هیستیدین 101 و آسپاراتات 307 میباشد ) 16.(12 ٥

6 جدول 2. تعداد آمینواسید و شماره آمینواسیدهاي دخیل در هر دومین فاکتور (2). X شماره آمینواسیدهاي دخیل در دومین دومینهاي فاکتورX دومین GLA دومین EGF-like 1 دومین EGF-like 2 دومین Peptidase S1 تعداد آمینواسید در هر دومین دومین سرین پروتي از ) SP ( دومین سرین پروتي از فاکتور X داراي 254 آمینو اسید است. تفاوت بسیار مهم فاکتور X فعال و زیموژن غیر فعال در آرایش و جهتگیري مجدد- N ترمینال دومین SP فاکتور X فعال میباشد که ناشی از شکست AP در پیوند پپتیدي بین آرژنین 194 و ایزولوسین 195 است. براي فعالسازي انتهاي آمینی ایزولوسین 195 به سمت جلو دومین سرین پروتي از تغییر جهت و آرایش داده و با تشکیل پل نمکی قوي ایی با آسپاراتات 378 به پایداري میرسد. این پدیده یک پدیده مهم براي تسهیل فعالیت کاتالیتیکی فاکتور X فعال است. سه باقیمانده آمینواسیدي فعال یعنی هیستیدین 236 آسپارتات 282 و سرین 379 نقش اساسی را در فعالیت کاتالیتیکی فاکتور Xa ایفا میکنند ) ). چندین مطالعه برروي میانکنش فاکتور Xa با مهارکننده نشان میدهد که کنفورماسیون سرین 379 (یکی از آمینواسیدهاي اصلی ناحیه فعال فاکتور ( Xa براساس ساختار مهارکننده و ماهیت میانکنش با آن تغییر میکند ) ). پپتید فعال حاوي 52 باقیمانده اسیدآمینه ایی ) سرین آرژنین 194 ( در یک لوپ دي سولفیدي خارجی 68 آمینواسیدي بین سیستي ین 132 و سیستي ین 302 واقع است. فرم فعال فاکتور X متحمل شکستی در دومین سرین پروتي از 240 آمینواسیدي (ایزولوسین لیزین ( 448 شده که سبب حذف باقیمانده اسید آمینه ایی آرژنین 140 و 142 میشود که سبب تشکیل ناحیه فعال کاتالیتیکی سهگانه متشکل از هیستیدین 236 آسپارتان 282 و سرین 379 را میشود ) ). نتیجهگیري دومین GLA داراي جزء ساختاري مهمی به نام - Ω لوپ است که داراي نقش دوگانه میباشد. این لوپ دو نوع آمینو اسید با ماهیت کاملا متفاوت را در خود جاي داده است. گروه اول آمینو اسیدهاي دو بار منفی Gla که به یون هاي کلسیم با بار مثبت متصل می شود و گروه دوم آمینو اسیدهاي هیدروفوبیک است که سبب اتصال هیدروفوبیک فاکتور X به غشا میشوند. مطالعات بسیاري نشان دادهاند که موتاسیون در 11 آمینواسید موجود در این لوپ موجب اختلال در اتصال فاکتور X و درنهایت اختلال در ٦

7 فعالیت آن میشود. از طرف دیگر دومین سرین پروتي از این فاکتور نقش اساس را در اتصال این پروتي ین به مهار کنندههایی مانند ZPI و PZ ایفا میکند و اتصال مهار کننده و فعال کننده به این ناحیه سبب مهار کردن و فعال کردن فاکتور X میشوند. علاوه بر این وجود لوپ متصل به کلسیم در دومین SP نقش عملکرد مهمی در حمایت دومین SP از پروتي ولیز دارد و همچنین سبب افزایش فعالیت آمیدولیتیک فاکتور Xa میشود. همچنین ناحیه متصل به کلسیم ممکن است در تشکیل کمپلکس پروترومبیناز نقش اساسی داشته باشد. این ناحیه از مشخصههاي بسیار مهم فاکتور X و دیگر سرین پروتي از هاست ) و ). 30 Refrences: 1. Abasali purkabireh R, Sheikh N. Biochemical mechanisms of blood coagulation. 1sted. Hamadan: University of Medical Sciences.2005;30-45.(Persian) 2. Persson E, Björk I, Stenflo J. Protein structural requirements for Ca2+ binding to the light chain of factor X. Studies using isolated intact fragments containing the gamma-carboxyglutamic acid region and/or the epidermal growth factor-like domains. J Biol Chem 2010;266(4): Persson E, Selander M, Linse S, Drakenberg T, Ohlin AK, Stenflo J. Calcium binding to the isolated beta-hydroxyaspartic acid- containing epidermal growth factor-like domain of bovine factor X. J Biol Chem. 1989;264(28): Venkateswarlu D, Perera L, Darden T, and Pedersen L.G. Structure and dynamics of zymogen human blood coagulation factor X. Biophys J 2002;82(3): Erem, Cihangir. Blood coagulation, fibrinolytic activity and lipid profile in subclinical thyroid disease: subclinical hyperthyroidism increases plasma factor X activity. Clinical ndocrinology 2006; 64(3): Stief, Thomas W. Single oxygen inactivates fibrinogen, factor V, factor VIII, factor X, and platelet aggregation of human blood. Thrombosis research 2000; 97(6): Häfner A, Merola F, Duportail G, Hutterer R, Schneider FW, Hof M. Calcium-induced conformational change in fragment 1-86 of factor X. Biopolymers 2000; 57(4): Riewald, Matthias, et al. Gene induction by coagulation factor Xa is mediated by activation of protease-activated receptor 1. Blood 2001;97(10): Mingozzi, Federico, et al. Induction of immune tolerance to coagulation factor IX antigen by in vivo hepatic gene transfer. The Journal of clinical investigation 2003; 111(9): ۷

8 10. Nielsen, V. G., B. M. Cohen, and E. Cohen. Effects of coagulation factor deficiency on plasma coagulation kinetics determined via Thrombelastography: critical roles of fibrinogen and Factors II, VII, X and XII. Acta anaesthesiologica scandinavica 2005; 49 (2): Mizuno, Hiroshi, et al. Crystal structure of an anticoagulant protein in complex with the Gla domain of factor X. Proceedings of the National Academy of Sciences 2001; 98 (13): Francischetti, Ivo MB, et al. Ixolaris, a novel recombinant tissue factor pathway inhibitor (TFPI) from the salivary gland of the tick, Ixodes scapularis: identification of factor X and factor Xa as scaffolds for the inhibition of factor VIIa/tissue factor complex. Blood 2002;99(10): Karimi Zahra, Falsafi-Zade Sajad, Galehdari Hamid. The role of Ca (2+) ions in the complex assembling of protein Z and Z-dependent protease inhibitor: A structure and dynamics investigation. Bioinformation 2012;8(9): Leadley, Jr. Coagulation factor Xa inhibition:biological background and rationale. Current topics in medicinal chemistry 2001;1(2): van Hylckama Vlieg, Astrid, et al. High levels of factor IX increase the risk of venous thrombosis. Blood 2000; 95 (12): Khrenov, Alexey V., Natalya M. Ananyeva, and Evgueni L. Saenko. Role of the B domain in proteolytic inactivation of activated coagulation factor VIII by activated protein C and activated factor X. Blood coagulation & fibrinolysis 2006;17(5): Dewerchin, Mieke, et al. Blood coagulation factor X deficiency causes partial embryonic lethality and fatal neonatal bleeding in mice.thrombosis and Haemostasis-Stuttgart. 2000;83(2): Kirchhofer, Daniel, et al. The tissue factor region that interacts with substrates factor IX and factor X. Biochemistry 2000; 39(25): Zhang L, Castellino FJ. The binding energy of human coagulation protein C to acidic phospholipid vesicles contains a major contribution from leucine 5 in the gamma- carboxyglutamic acid domain. J Biol Chem 1994;269(5): ۸

9 20. Bergum, Peter. Role of zymogen and activated factor X as scaffolds for the inhibition of the blood coagulation factor VIIa-tissue factor complex by recombinant nematode anticoagulant protein c2. Journal of Biological Chemistry 2001;276(13): Huang, X., Swanson, R., Broze, G. J., & Olson, S. T. Kinetic characterization of the protein Z- dependent protease inhibitor reaction with blood coagulation factor Xa. Journal of Biological Chemistry. 2008;283(44): Bode W, Schwager P. The refined crystal structure of bovine beta-trypsin at 1,8 A resolution. II. Crystallographic refinement, calcium binding site, benzamidine binding site and active site at ph 7,0. J Mol Biol 2005;98(4): Brandstetter H, Kühne A, Bode W, Huber R, von der Saal W, Wirthensohn K, Engh RA. X- ray structure of active site-inhibited clotting factor Xa. Implications for drug design and substrate recognition. J Biol Chem 2006;271(47): Di Scipio, R. G., Hermodson, M. A., Yates, S. G., & Davie, E. W. A comparison of human prothrombin, factor IX (Christmas factor), factor X (Stuart factor), and protein S. Biochemistry 2008;16(4): Camerer, E., Huang, W., & Coughlin, S. R.Tissue factor-and factor X-dependent activation of protease-activated receptor 2 by factor VIIa. Proceedings of the National Academy of Sciences 2000;97(10): Duchemin, J., Pan-Petesch, B., Arnaud, B., Blouch, M., & Abgrall, J. Influence of coagulation factors and tissue factor concentration on the thrombin generation test in plasma. Thrombosis and Haemostasis-Stuttgart-2008;99(4): Broze, George J. Protein Z-dependent regulation of coagulation.thrombosis And Haemostasis- Stuttgart 2001; 86 (1): Uprichard, James, and David J. Perry. Factor X deficiency. Blood reviews 2002;16(2): Forastiero, R. R., et al. Autoimmune antiphospholipid antibodies impair the inhibition of activated factor X by protein Z/protein Z-dependent protease inhibitor. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2003;1(8): Scotton, C. J., Krupiczojc, M. A., Königshoff, M., Mercer, P. F., Lee, Y. G., Kaminski, N., & Chambers, R. C. Increased local expression of coagulation factor X contributes to the fibrotic ۹

10 response in human and murine lung injury. The Journal of clinical investigation 2009;119(9): Erem, C. Blood coagulation, fibrinolytic activity and lipid profile in subclinical thyroid disease: subclinical hyperthyroidism increases plasma factor X activity. Clinical endocrinology 2006;64(3): Key, N. S., & Negrier, C. Coagulation factor concentrates: past, present, and future. The Lancet 2007; 370(9585): Biol Chem 1994; 269(5): of Thrombosis and Haemostasis 2003;1(8): ۱۰